Javascript ถูกปิดการใช้งานในเบราว์เซอร์ของคุณเมื่อปิดการใช้งานจาวาสคริปต์ ฟังก์ชันบางอย่างของเว็บไซต์นี้จะไม่ทำงาน
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonia, สเปน * ผู้เขียนเหล่านี้มีข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับงานนี้อย่างเท่าเทียมกัน ภูมิหลังการสนับสนุน: กรดไฮยาลูโรนิก (HA) เป็นโพลีแซ็กคาไรด์ที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติซึ่งใช้ในการผลิตสารตัวเติมทางผิวหนังเพื่อความสวยงามเนื่องจากมีครึ่งชีวิตในเนื้อเยื่อของมนุษย์เป็นเวลาหลายวัน สารเติมเต็มทางผิวหนังที่มี HA จึงถูกดัดแปลงทางเคมีเพื่อยืดอายุในร่างกายการดัดแปลงที่พบบ่อยที่สุดในสารตัวเติมที่มี HA เชิงพาณิชย์คือการใช้ 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) เป็นสารเชื่อมขวางเพื่อเชื่อมขวางสายโซ่ HABDDE ที่ตกค้างหรือไม่ทำปฏิกิริยาถือว่าไม่เป็นพิษที่ <2 ส่วนต่อล้าน (ppm)ดังนั้น BDDE ที่เหลือในฟิลเลอร์ผิวหนังขั้นสุดท้ายจะต้องถูกวัดปริมาณเพื่อความปลอดภัยของผู้ป่วยวัสดุและวิธีการ: การศึกษานี้อธิบายการตรวจหาและการกำหนดลักษณะเฉพาะของผลิตภัณฑ์พลอยได้ของปฏิกิริยาเชื่อมขวางระหว่าง BDDE และ HA ภายใต้สภาวะที่เป็นด่างโดยการรวมโครมาโตกราฟีของเหลวและแมสสเปกโตรเมตรี (LC-MS)ผลลัพธ์: หลังจากการวิเคราะห์ที่แตกต่างกัน พบว่าสภาวะที่เป็นด่างและอุณหภูมิสูงที่ใช้ในการฆ่าเชื้อไฮโดรเจล HA-BDDE ส่งเสริมการก่อตัวของผลพลอยได้ใหม่นี้ ซึ่งเป็นสารประกอบ "คล้ายโพรพิลีนไกลคอล"การวิเคราะห์ด้วย LC-MS ยืนยันว่าผลพลอยได้มีมวลไอโซโทปเดียวที่เหมือนกันกับ BDDE, เวลาการคงอยู่ (tR) ที่ต่างกัน และโหมดการดูดกลืนแสงยูวี (λ=200 นาโนเมตร) ที่ต่างกันต่างจาก BDDE ที่สังเกตพบในการวิเคราะห์ LC-MS ว่าภายใต้เงื่อนไขการวัดเดียวกัน ผลพลอยได้นี้มีอัตราการตรวจจับที่สูงกว่าที่ 200 นาโนเมตรสรุป: ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าไม่มีอีพอกไซด์ในโครงสร้างของสารประกอบใหม่นี้การอภิปรายเปิดกว้างเพื่อประเมินความเสี่ยงของผลิตภัณฑ์พลอยได้ใหม่นี้ที่พบในการผลิตไฮโดรเจล HA-BDDE (สารเติมเต็มทางผิวหนัง HA) เพื่อวัตถุประสงค์ทางการค้าคำสำคัญ: กรดไฮยาลูโรนิก, สารเติมแต่งผิวหนัง HA, กรดไฮยาลูโรนิกเชื่อมขวาง, BDDE, การวิเคราะห์ LC-MS, ผลพลอยได้ของ BDDE
สารตัวเติมที่มีกรดไฮยาลูโรนิก (HA) เป็นสารตัวเติมทางผิวหนังที่นิยมใช้กันทั่วไปในเครื่องสำอาง1 ฟิลเลอร์ที่ผิวหนังนี้เป็นไฮโดรเจล ซึ่งปกติประกอบด้วยน้ำ >95% และ HA 0.5-3% ซึ่งทำให้โครงสร้างเหมือนเจล2 HA เป็นพอลิแซ็กคาไรด์และเป็นองค์ประกอบหลักของเมทริกซ์นอกเซลล์ของสัตว์มีกระดูกสันหลังหนึ่งในส่วนผสมประกอบด้วย (1,4) -glucuronic acid-β (1,3) -N-acetylglucosamine (GlcNAc) ซ้ำหน่วยไดแซ็กคาไรด์ที่เชื่อมต่อด้วยพันธะไกลโคซิดิกรูปแบบไดแซ็กคาไรด์นี้เหมือนกันในทุกสิ่งมีชีวิตเมื่อเทียบกับสารตัวเติมที่มีโปรตีนบางชนิด (เช่น คอลลาเจน) คุณสมบัตินี้ทำให้ HA เป็นโมเลกุลที่เข้ากันได้ทางชีวภาพสูงสารตัวเติมเหล่านี้สามารถแสดงความจำเพาะของลำดับกรดอะมิโนที่อาจรับรู้โดยระบบภูมิคุ้มกันของผู้ป่วย
เมื่อใช้เป็นฟิลเลอร์ผิวหนัง ข้อจำกัดหลักของ HA คือการหมุนเวียนอย่างรวดเร็วภายในเนื้อเยื่อเนื่องจากการมีอยู่ของเอนไซม์ในตระกูลที่เรียกว่าไฮยาลูโรนิเดสจนถึงปัจจุบัน มีการอธิบายการดัดแปลงทางเคมีหลายอย่างในโครงสร้าง HA เพื่อเพิ่มครึ่งชีวิตของ HA ในเนื้อเยื่อ3 การดัดแปลงส่วนใหญ่เหล่านี้พยายามที่จะลดการเข้าถึงของไฮยาลูโรนิเดสไปยังพอลิแซ็กคาไรด์พอลิเมอร์โดยการเชื่อมโยงโซ่ HA แบบเชื่อมขวางดังนั้น เนื่องจากการก่อรูปของสะพานเชื่อมและพันธะโควาเลนต์ระหว่างโมเลกุลระหว่างโครงสร้าง HA และสารเชื่อมขวาง ไฮโดรเจล HA ที่เชื่อมโยงข้ามผลิตผลิตภัณฑ์การเสื่อมสภาพที่ต้านเอนไซม์มากกว่า HA ตามธรรมชาติ4-6
จนถึงปัจจุบัน สารเชื่อมขวางทางเคมีที่ใช้ในการผลิต HA เชื่อมขวาง ได้แก่ เมทาคริลาไมด์ 7 ไฮดราไซด์ 8 คาร์โบไดอิไมด์ 9 ไดวินิลซัลโฟน 1,4-บิวเทนไดออล ไดไกลซิดิลอีเทอร์ (BDDE) และโพลี (เอทิลีนไกลคอล) ไดไกลซิดิลอีเทอร์10 ,11 BDDE เป็นสารเชื่อมขวางที่ใช้กันมากที่สุดในปัจจุบันแม้ว่าไฮโดรเจลชนิดนี้ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าปลอดภัยมานานหลายทศวรรษ, สารเชื่อมขวางที่ใช้คือสารทำปฏิกิริยาที่อาจเป็นพิษต่อเซลล์และ, ในบางกรณี, ทำให้เกิดการกลายพันธุ์12 ดังนั้น ปริมาณสารตกค้างในไฮโดรเจลขั้นสุดท้ายต้องสูงBDDE ถือว่าปลอดภัยเมื่อความเข้มข้นที่เหลือน้อยกว่า 2 ส่วนในล้าน (ppm)4
มีหลายวิธีในการตรวจจับความเข้มข้นของ BDDE ที่มีสารตกค้างต่ำ ระดับการเชื่อมโยงข้ามและตำแหน่งการแทนที่ในไฮโดรเจล HA เช่น แก๊สโครมาโตกราฟี, โครมาโตกราฟีแบบแยกตามขนาดที่ควบคู่กับแมสสเปกโตรเมทรี (MS), วิธีวัดการเรืองแสงด้วยคลื่นแม่เหล็กไฟฟ้านิวเคลียร์ (NMR) และ อาร์เรย์ไดโอดควบคู่ไปกับโครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC)13-17 การศึกษานี้อธิบายการตรวจหาและการกำหนดลักษณะเฉพาะของผลิตภัณฑ์พลอยได้ในไฮโดรเจล HA แบบเชื่อมขวางขั้นสุดท้ายที่เกิดจากปฏิกิริยาของ BDDE และ HA ภายใต้สภาวะที่เป็นด่างHPLC และโครมาโตกราฟี-แมสสเปกโตรเมทรีเหลว (การวิเคราะห์ LC-MS)เนื่องจากไม่ทราบความเป็นพิษของผลิตภัณฑ์พลอยได้ของ BDDE เราจึงแนะนำว่าควรหาปริมาณสารตกค้างในลักษณะที่คล้ายคลึงกับวิธีการที่มักดำเนินการกับ BDDE ในผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย
เกลือโซเดียมที่ได้รับของ HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) มีน้ำหนักโมเลกุล ~1,368,000 Da (วิธี Laurent) 18 และความหนืดที่แท้จริง 2.20 m3/kgสำหรับปฏิกิริยาเชื่อมขวาง BDDE (≥95%) ถูกซื้อจาก Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟตที่มีค่า pH 7.4 ถูกซื้อจากบริษัท Sigma-Aldrichตัวทำละลาย, อะซีโตไนไทรล์และน้ำทั้งหมดที่ใช้ในการวิเคราะห์ LC-MS ถูกซื้อมาจากคุณภาพระดับ HPLCซื้อกรดฟอร์มิก (98%) เป็นเกรดรีเอเจนต์
การทดลองทั้งหมดดำเนินการบนระบบ UPLC Acquity (วอเตอร์ส, มิลฟอร์ด, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา) และเชื่อมต่อกับแมสสเปกโตรมิเตอร์แบบสามทางสี่เท่าของ API 3000 ที่ติดตั้งแหล่งกำเนิดอิออไนเซชันด้วยไฟฟ้าสเปรย์ (AB SCIEX, Framingham, MA, USA)
การสังเคราะห์ของไฮโดรเจล HA แบบเชื่อมขวางถูกเริ่มต้นโดยการเติม BDDE 198 มก. ให้กับสารละลายโซเดียม ไฮยาลูโรเนต (NaHA) 10% (น้ำหนัก/น้ำหนัก) ต่อหน้า 1% อัลคาไล (โซเดียม ไฮดรอกไซด์, NaOH)ความเข้มข้นของ BDDE สุดท้ายในของผสมปฏิกิริยาคือ 9.9 มก./มล. (0.049 มิลลิโมลาร์)จากนั้น, ของผสมของปฏิกิริยาถูกผสมอย่างทั่วถึงและทำให้เป็นเนื้อเดียวกันและปล่อยให้ดำเนินต่อไปที่ 45°C เป็นเวลา 4 ชั่วโมง19 pH ของปฏิกิริยาคงอยู่ที่ ~12
หลังจากนั้น ของผสมของปฏิกิริยาถูกล้างด้วยน้ำ และไฮโดรเจล HA-BDDE สุดท้ายถูกกรองและเจือจางด้วยบัฟเฟอร์ PBS เพื่อให้ได้ความเข้มข้น HA ที่ 10 ถึง 25 มก./มล. และ pH สุดท้ายที่ 7.4ในการฆ่าเชื้อไฮโดรเจล HA ที่เชื่อมขวางที่ผลิตขึ้น ไฮโดรเจลเหล่านี้ทั้งหมดถูกนึ่งฆ่าเชื้อด้วยไอน้ำ (120°C เป็นเวลา 20 นาที)ไฮโดรเจล BDDE-HA ที่บริสุทธิ์ถูกเก็บไว้ที่ 4°C จนกระทั่งทำการวิเคราะห์
เพื่อวิเคราะห์ BDDE ที่มีอยู่ในผลิตภัณฑ์ HA แบบเชื่อมขวาง ตัวอย่างขนาด 240 มก. ถูกชั่งน้ำหนักและนำเข้ารูตรงกลาง (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; ปริมาตร 0.5 มล.) และหมุนเหวี่ยงที่ 10,000 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิห้อง 10 นาทีรวบรวมและวิเคราะห์ของเหลวแบบดึงลงทั้งหมด 20 ไมโครลิตร
เพื่อวิเคราะห์มาตรฐาน BDDE (Sigma-Aldrich Co) ภายใต้สภาวะที่เป็นด่าง (1%, 0.1% และ 0.01% NaOH) หากตรงตามเงื่อนไขต่อไปนี้ ตัวอย่างของเหลวคือ 1:10, 1:100 หรือสูงถึง 1:1,000,000 หากจำเป็น ให้ใช้น้ำปราศจากไอออน MilliQ สำหรับการวิเคราะห์
สำหรับวัสดุตั้งต้นที่ใช้ในปฏิกิริยาเชื่อมขวาง (HA 2%, H2O, 1% NaOH และ 0.049 mM BDDE) 1 มล. ของแต่ละตัวอย่างที่เตรียมจากวัสดุเหล่านี้ถูกวิเคราะห์โดยใช้สภาวะการวิเคราะห์เดียวกัน
เพื่อตรวจสอบความจำเพาะของพีคที่ปรากฏในแผนผังไอออน สารละลายมาตรฐาน 10 µL ที่ 100 ppb BDDE (Sigma-Aldrich Co) ถูกเติมลงในตัวอย่าง 20 µLในกรณีนี้ ความเข้มข้นสุดท้ายของมาตรฐานในแต่ละตัวอย่างคือ 37 ppb
ขั้นแรก เตรียมสารละลายสต็อก BDDE ที่มีความเข้มข้น 11,000 มก./ลิตร (11,000 ppm) โดยการเจือจาง BDDE มาตรฐาน 10 ไมโครลิตร (Sigma-Aldrich Co) ด้วยน้ำ MilliQ 990 ไมโครลิตร (ความหนาแน่น 1.1 ก./มล.)ใช้สารละลายนี้เพื่อเตรียมสารละลาย BDDE 110 ไมโครกรัม/ลิตร (110 ppb) เป็นตัวเจือจางมาตรฐานระดับกลางจากนั้น ใช้ตัวเจือจางมาตรฐาน BDDE ระดับกลาง (110 ppb) เพื่อเตรียมเส้นโค้งมาตรฐานโดยเจือจางสารเจือจางระดับกลางหลายๆ ครั้งเพื่อให้ได้ความเข้มข้นที่ต้องการ 75, 50, 25, 10 และ 1 ppbดังแสดงในรูปที่ 1 พบว่าเส้นโค้งมาตรฐาน BDDE จาก 1.1 ถึง 110 ppb มีความเป็นเส้นตรงที่ดี (R2>0.99)เส้นโค้งมาตรฐานถูกทำซ้ำในการทดลองอิสระสี่ครั้ง
รูปที่ 1 กราฟการปรับเทียบมาตรฐาน BDDE ที่ได้จากการวิเคราะห์ LC-MS ซึ่งสังเกตพบความสัมพันธ์ที่ดี (R2>0.99)
ตัวย่อ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl อีเธอร์;LC-MS, โครมาโตกราฟีของเหลวและแมสสเปกโตรเมตรี
เพื่อที่จะระบุและหาปริมาณมาตรฐาน BDDE ที่มีอยู่ใน HA แบบเชื่อมขวางและมาตรฐาน BDDE ในสารละลายพื้นฐาน การวิเคราะห์ LC-MS ถูกนำมาใช้
การแยกสารด้วยโครมาโตกราฟีทำได้บนคอลัมน์ LUNA 2.5 µm C18(2)-HST (50×2.0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) และเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง (25°C) ระหว่างการวิเคราะห์เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยอะซิโตไนไตรล์ (ตัวทำละลาย A) และน้ำ (ตัวทำละลาย B) ที่มีกรดฟอร์มิก 0.1%เฟสเคลื่อนที่ถูกชะด้วยการชะแบบเกรเดียนท์การไล่ระดับสีเป็นดังนี้: 0 นาที, 2% A;1 นาที, 2% A;6 นาที 98% A;7 นาที 98% A;7.1 นาที, 2% A;10 นาที 2% A. เวลาในการทำงานคือ 10 นาที และปริมาตรในการฉีดคือ 20 µLเวลาเก็บรักษา BDDE ประมาณ 3.48 นาที (ตั้งแต่ 3.43 ถึง 4.14 นาทีตามการทดลอง)เฟสเคลื่อนที่ถูกสูบที่อัตราการไหล 0.25 มล./นาทีสำหรับการวิเคราะห์ LC-MS
สำหรับการวิเคราะห์ BDDE และการหาปริมาณโดย MS ระบบ UPLC (น้ำ) จะถูกรวมเข้ากับแมสสเปกโตรมิเตอร์แบบสามสี่เท่าของ API 3000 (AB SCIEX) ที่ติดตั้งแหล่งกำเนิดไอออนไนซ์ของสเปรย์ด้วยไฟฟ้า และการวิเคราะห์จะดำเนินการในโหมดไอออนบวก (ESI+)
จากการวิเคราะห์ชิ้นส่วนอิออนที่ดำเนินการบน BDDE ชิ้นส่วนที่มีความเข้มสูงสุดถูกกำหนดให้เป็นชิ้นส่วนที่สอดคล้องกับ 129.1 Da (รูปที่ 6)ดังนั้น ในโหมดการตรวจสอบหลายไอออน (MIM) สำหรับการหาปริมาณ การแปลงมวล (อัตราส่วนมวลต่อประจุ [m/z]) ของ BDDE คือ 203.3/129.1 Daนอกจากนี้ยังใช้โหมดการสแกนแบบเต็ม (FS) และโหมดการสแกนไอออนของผลิตภัณฑ์ (PIS) สำหรับการวิเคราะห์ LC-MS
เพื่อตรวจสอบความจำเพาะของวิธีการ ได้ทำการวิเคราะห์ตัวอย่างเปล่า (เฟสเคลื่อนที่เริ่มต้น)ไม่พบสัญญาณในตัวอย่างเปล่าที่มีการแปลงมวลเป็น 203.3/129.1 Daเกี่ยวกับความสามารถในการทำซ้ำของการทดลอง ได้ทำการวิเคราะห์การฉีดมาตรฐาน 10 ครั้ง ที่ 55 ppb (ตรงกลางเส้นโค้งการสอบเทียบ) ส่งผลให้ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานตกค้าง (RSD) <5% (ไม่แสดงข้อมูล)
ปริมาณ BDDE ที่ตกค้างถูกหาปริมาณในไฮโดรเจล HA ที่เชื่อมโยงข้าม BDDE แบบอัตโนมัติที่ต่างกันแปดชนิด ซึ่งสอดคล้องกับการทดลองอิสระสี่การทดลองตามที่อธิบายไว้ในส่วน "วัสดุและวิธีการ" การหาปริมาณจะได้รับการประเมินโดยค่าเฉลี่ยของเส้นโค้งการถดถอยของการเจือจางมาตรฐาน BDDE ซึ่งสอดคล้องกับจุดสูงสุดเฉพาะที่ตรวจพบที่การเปลี่ยนแปลงมวล BDDE ที่ 203.3/129.1 Da พร้อมการคงอยู่ เวลา 3.43 ถึง 4.14 นาที ไม่รอรูปที่ 2 แสดงตัวอย่างโครมาโตแกรมของมาตรฐานอ้างอิง 10 ppb BDDEตารางที่ 1 สรุปปริมาณ BDDE ที่เหลือของไฮโดรเจลที่ต่างกันแปดชนิดช่วงค่าคือ 1 ถึง 2.46 ppbดังนั้นความเข้มข้น BDDE ที่ตกค้างในตัวอย่างจึงเป็นที่ยอมรับสำหรับการใช้งานของมนุษย์ (<2 ppm)
รูปที่ 2 โครมาโตแกรมไอออนของ 10 ppb มาตรฐานอ้างอิง BDDE (Sigma-Aldrich Co), การเปลี่ยนแปลงของ MS (m/z) ที่ได้รับจากการวิเคราะห์ LC-MS ที่ 203.30/129.10 Da (ในโหมด MRM เชิงบวก)
ตัวย่อ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl อีเธอร์;LC-MS, โครมาโตกราฟีของเหลวและแมสสเปกโตรเมตรีMRM การตรวจสอบปฏิกิริยาหลายรายการMS, มวล;m/z อัตราส่วนมวลต่อการชาร์จ
หมายเหตุ: ตัวอย่างที่ 1-8 เป็นไฮโดรเจล HA ที่เชื่อมขวาง BDDE แบบอัตโนมัติปริมาณที่เหลือของ BDDE ในไฮโดรเจลและเวลาสูงสุดของการคงอยู่ของ BDDE ยังถูกรายงานอีกด้วยสุดท้าย มีการรายงานการมีอยู่ของจุดสูงสุดใหม่ที่มีเวลาเก็บรักษาต่างกัน
ตัวย่อ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl อีเธอร์;HA, กรดไฮยาลูโรนิก;MRM การตรวจสอบปฏิกิริยาหลายรายการtR, เวลาเก็บรักษา;LC-MS, โครมาโตกราฟีของเหลวและแมสสเปกโตรเมตรีRRT เวลาเก็บรักษาสัมพัทธ์
น่าแปลกที่การวิเคราะห์ของโครมาโตแกรมไอออน LC-MS แสดงให้เห็นว่าบนพื้นฐานของตัวอย่างไฮโดรเจล HA ที่เชื่อมโยงข้ามแบบอัตโนมัติทั้งหมดที่วิเคราะห์ มีพีคพิเศษที่เวลาการคงอยู่สั้นกว่า 2.73 ถึง 3.29 นาทีตัวอย่างเช่น รูปที่ 3 แสดงโครมาโตแกรมไอออนของตัวอย่าง HA ที่เชื่อมขวาง โดยพีคเพิ่มเติมปรากฏขึ้นที่เวลาการคงอยู่ที่แตกต่างกันประมาณ 2.71 นาทีเวลาเก็บรักษาสัมพัทธ์ที่สังเกตได้ (RRT) ระหว่างพีคที่สังเกตใหม่และพีคจาก BDDE พบว่าเป็น 0.79 (ตารางที่ 1)เนื่องจากเรารู้ว่าพีคที่สังเกตใหม่ถูกคงไว้น้อยกว่าในคอลัมน์ C18 ที่ใช้ในการวิเคราะห์ LC-MS พีคใหม่อาจสอดคล้องกับสารประกอบที่มีขั้วมากกว่า BDDE
รูปที่ 3 โครมาโตแกรมไอออนของตัวอย่างไฮโดรเจล HA ที่เชื่อมขวางที่ได้มาโดย LC-MS (การแปลงมวล MRM 203.3/129.0 Da)
ตัวย่อ: HA, กรดไฮยาลูโรนิก;LC-MS, โครมาโตกราฟีของเหลวและแมสสเปกโตรเมตรีMRM การตรวจสอบปฏิกิริยาหลายรายการRRT เวลาเก็บรักษาสัมพัทธ์tR เวลาเก็บรักษา
เพื่อที่จะแยกแยะความเป็นไปได้ที่พีคใหม่ที่สังเกตพบอาจเป็นสารปนเปื้อนที่มีอยู่เดิมในวัตถุดิบที่ใช้ วัตถุดิบเหล่านี้ยังถูกวิเคราะห์โดยใช้วิธีการวิเคราะห์ LC-MS เดียวกันวัสดุตั้งต้นที่วิเคราะห์รวมถึงน้ำ NaHA 2% ในน้ำ 1% NaOH ในน้ำ และ BDDE ที่ความเข้มข้นเดียวกันกับที่ใช้ในปฏิกิริยาเชื่อมขวางโครมาโตแกรมแบบไอออนของวัสดุตั้งต้นที่ใช้ไม่แสดงสารประกอบหรือพีคใดๆ และเวลาการคงอยู่ของมันสอดคล้องกับพีคใหม่ที่สังเกตพบข้อเท็จจริงนี้ละทิ้งแนวคิดที่ว่าไม่เพียงแต่วัสดุเริ่มต้นเท่านั้นที่อาจมีสารประกอบหรือสารที่อาจรบกวนขั้นตอนการวิเคราะห์ แต่ไม่มีสัญญาณของการปนเปื้อนข้ามที่เป็นไปได้กับผลิตภัณฑ์ในห้องปฏิบัติการอื่นๆค่าความเข้มข้นที่ได้รับหลังจากการวิเคราะห์ LC-MS ของ BDDE และพีคใหม่แสดงไว้ในตารางที่ 2 (ตัวอย่างที่ 1-4) และโครมาโตแกรมของไอออนในรูปที่ 4
หมายเหตุ: ตัวอย่างที่ 1-4 สอดคล้องกับวัตถุดิบที่ใช้ในการผลิตไฮโดรเจล HA ที่เชื่อมขวาง BDDE แบบอัตโนมัติตัวอย่างเหล่านี้ไม่ได้ผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อ
ตัวย่อ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl อีเธอร์;HA, กรดไฮยาลูโรนิก;LC-MS, โครมาโตกราฟีของเหลวและแมสสเปกโตรเมตรีMRM การตรวจสอบปฏิกิริยาหลายรายการ
รูปที่ 4 สอดคล้องกับโครมาโตแกรม LC-MS ของตัวอย่างของวัตถุดิบที่ใช้ในปฏิกิริยาเชื่อมขวางของ HA และ BDDE
หมายเหตุ: สิ่งเหล่านี้ถูกวัดที่ความเข้มข้นและอัตราส่วนเดียวกันที่ใช้เพื่อทำปฏิกิริยาเชื่อมขวางตัวเลขสำหรับวัตถุดิบที่วิเคราะห์โดยโครมาโตแกรมสอดคล้องกับ: (1) น้ำ (2) 2% HA สารละลายในน้ำ (3) 1% NaOH สารละลายในน้ำการวิเคราะห์ LC-MS ดำเนินการสำหรับการแปลงมวลเป็น 203.30/129.10 Da (ในโหมด MRM บวก)
ตัวย่อ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl อีเธอร์;HA, กรดไฮยาลูโรนิก;LC-MS, โครมาโตกราฟีของเหลวและแมสสเปกโตรเมตรีMRM การตรวจสอบปฏิกิริยาหลายรายการ
ศึกษาเงื่อนไขที่นำไปสู่การก่อตัวของยอดเขาใหม่เพื่อที่จะศึกษาว่าสภาวะของปฏิกิริยาที่ใช้เพื่อผลิตไฮโดรเจล HA ที่ถูกเชื่อมขวางส่งผลต่อความไวปฏิกิริยาของสารเชื่อมขวาง BDDE ที่นำไปสู่การก่อรูปของพีคใหม่ (ผลพลอยได้ที่เป็นไปได้) การวัดที่ต่างกันถูกดำเนินการในการกำหนดเหล่านี้ เราศึกษาและวิเคราะห์ตัวเชื่อมขวาง BDDE สุดท้าย ซึ่งบำบัดด้วย NaOH ที่มีความเข้มข้นต่างกัน (0%, 1%, 0.1% และ 0.01%) ในตัวกลางที่เป็นน้ำ ตามด้วยหรือไม่มีการนึ่งฆ่าเชื้อขั้นตอนแบคทีเรียเพื่อจำลองสภาวะเดียวกันจะเหมือนกับวิธีการที่ใช้ในการผลิตไฮโดรเจล HA แบบเชื่อมขวางตามที่อธิบายไว้ในส่วน "วัสดุและวิธีการ" การเปลี่ยนแปลงมวลของตัวอย่างถูกวิเคราะห์โดย LC-MS ถึง 203.30/129.10 DaBDDE และความเข้มข้นของพีคใหม่ถูกคำนวณ และผลลัพธ์ถูกแสดงในตารางที่ 3 ไม่พบพีคใหม่ในตัวอย่างที่ไม่ได้ผ่านการนึ่งฆ่าเชื้อ โดยไม่คำนึงถึงการมีอยู่ของ NaOH ในสารละลาย (ตัวอย่างที่ 1-4, ตาราง 3).สำหรับตัวอย่างที่นึ่งฆ่าเชื้อแล้ว พีคใหม่จะถูกตรวจพบเมื่อมี NaOH ในสารละลายเท่านั้น และการก่อตัวของพีคดูเหมือนว่าจะขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของ NaOH ในสารละลาย (ตัวอย่างที่ 5-8 ตารางที่ 3) (RRT = 0.79)รูปที่ 5 แสดงตัวอย่างของไอออนโครมาโตแกรม ซึ่งแสดงตัวอย่างนึ่งฆ่าเชื้ออัตโนมัติสองตัวอย่างโดยมีหรือไม่มี NAOH
ตัวย่อ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl อีเธอร์;LC-MS, โครมาโตกราฟีของเหลวและแมสสเปกโตรเมตรีMRM การตรวจสอบปฏิกิริยาหลายรายการ
หมายเหตุ: โครมาโตแกรมบนสุด: ตัวอย่างถูกบำบัดด้วยสารละลายน้ำ NaOH 0.1% และหม้อนึ่งฆ่าเชื้อ (120°C เป็นเวลา 20 นาที)โครมาโตแกรมด้านล่าง: ตัวอย่างไม่ได้รับการบำบัดด้วย NaOH แต่ถูกนึ่งฆ่าเชื้อภายใต้สภาวะเดียวกันการแปลงมวลเป็น 203.30/129.10 Da (ในโหมด MRM บวก) ถูกวิเคราะห์โดย LC-MS
ตัวย่อ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl อีเธอร์;LC-MS, โครมาโตกราฟีของเหลวและแมสสเปกโตรเมตรีMRM การตรวจสอบปฏิกิริยาหลายรายการ
ในตัวอย่าง autoclaved ทั้งหมด โดยมีหรือไม่มี NaOH ความเข้มข้นของ BDDE ลดลงอย่างมาก (มากถึง 16.6 เท่า) (ตัวอย่างที่ 5-8, ตารางที่ 2)การลดลงของความเข้มข้นของ BDDE อาจเนื่องมาจากข้อเท็จจริงที่ว่าที่อุณหภูมิสูง น้ำสามารถทำหน้าที่เป็นเบส (นิวคลีโอไฟล์) เพื่อเปิดวงแหวนอีพอกไซด์ของ BDDE เพื่อสร้างสารประกอบ 1,2-ไดออลคุณภาพโมโนไอโซโทปของสารประกอบนี้แตกต่างจากของ BDDE ดังนั้นจึงไม่ได้รับผลกระทบLC-MS ตรวจพบการเปลี่ยนแปลงมวล 203.30/129.10 Da
ในที่สุด การทดลองเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการสร้างพีคใหม่ขึ้นอยู่กับการมีอยู่ของ BDDE, NAOH และกระบวนการนึ่งฆ่าเชื้อ แต่ไม่มีส่วนเกี่ยวข้องกับ HA
พีคใหม่ที่พบที่เวลาคงอยู่ประมาณ 2.71 นาทีจากนั้นถูกแสดงคุณลักษณะโดย LC-MSเพื่อความมุ่งหมายนี้ BDDE (9.9 มก./มล.) ถูกบ่มในสารละลายที่มีน้ำ NaOH 1% และนึ่งฆ่าเชื้ออัตโนมัติในตารางที่ 4 ลักษณะของพีคใหม่จะถูกเปรียบเทียบกับพีคอ้างอิง BDDE ที่รู้จัก (เวลาเก็บรักษาประมาณ 3.47 นาที)จากการวิเคราะห์การกระจายตัวของไอออนของพีคทั้งสอง สามารถสรุปได้ว่าพีคที่มีเวลาเก็บรักษา 2.72 นาทีแสดงชิ้นส่วนเดียวกันกับพีค BDDE แต่มีความเข้มต่างกัน (รูปที่ 6)สำหรับพีคที่สอดคล้องกับเวลาการคงอยู่ (PIS) ที่ 2.72 นาที พีคที่รุนแรงยิ่งขึ้นถูกสังเกตพบหลังจากการแตกแฟรกเมนต์ที่มวล 147 Daที่ความเข้มข้น BDDE (9.9 มก./มล.) ที่ใช้ในการหาค่านี้ โหมดการดูดกลืนแสงที่ต่างกัน (UV, λ=200 นาโนเมตร) ในสเปกตรัมอัลตราไวโอเลตยังถูกสังเกตพบหลังการแยกด้วยโครมาโตกราฟี (รูปที่ 7)พีคที่มีเวลาคงอยู่ 2.71 นาทียังคงมองเห็นได้ที่ 200 นาโนเมตร ในขณะที่พีค BDDE ไม่สามารถสังเกตได้ในโครมาโตแกรมภายใต้สภาวะเดียวกัน
ตารางที่ 4 ผลการจำแนกลักษณะของพีคใหม่ด้วยเวลาเก็บรักษาประมาณ 2.71 นาที และพีค BDDE ด้วยเวลาเก็บรักษา 3.47 นาที
หมายเหตุ: เพื่อให้ได้ผลลัพธ์เหล่านี้ การวิเคราะห์ LC-MS และ HPLC (MRM และ PIS) ถูกดำเนินการบนสองพีคสำหรับการวิเคราะห์ HPLC จะใช้การตรวจจับรังสียูวีที่ความยาวคลื่น 200 นาโนเมตร
ตัวย่อ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl อีเธอร์;HPLC, โครมาโตกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง;LC-MS, โครมาโตกราฟีของเหลวและแมสสเปกโตรเมตรีMRM การตรวจสอบปฏิกิริยาหลายรายการm/z, อัตราส่วนมวลต่อการชาร์จ;PIS, การสแกนไอออนของผลิตภัณฑ์;แสงอัลตราไวโอเลตแสงอัลตราไวโอเลต
หมายเหตุ: ชิ้นส่วนมวลได้มาจากการวิเคราะห์ LC-MS (PIS)โครมาโตแกรมด้านบน: สเปกตรัมมวลของชิ้นส่วนตัวอย่างมาตรฐาน BDDEโครมาโตแกรมด้านล่าง: สเปกตรัมมวลของพีคใหม่ที่ตรวจพบ (RRT ที่เกี่ยวข้องกับพีค BDDE คือ 0.79)BDDE ถูกประมวลผลในสารละลาย NaOH 1% และหม้อนึ่งฆ่าเชื้อ
ตัวย่อ: BDDE, 1,4-butanediol diglycidyl อีเธอร์;LC-MS, โครมาโตกราฟีของเหลวและแมสสเปกโตรเมตรีMRM การตรวจสอบปฏิกิริยาหลายรายการPIS, การสแกนไอออนของผลิตภัณฑ์;RRT เวลาเก็บรักษาสัมพัทธ์
รูปที่ 7 Ion chromatogram ของ 203.30 Da precursor ion และ (A) พีคใหม่ที่มีเวลาการคงอยู่ 2.71 นาที และ (B) การตรวจจับ UV ของพีคมาตรฐานอ้างอิง BDDE ที่ 3.46 นาทีที่ 200 nm
ในไฮโดรเจล HA ที่ถูกเชื่อมโยงข้ามทั้งหมดที่ผลิตขึ้น มันถูกสังเกตว่าความเข้มข้นของ BDDE ที่เหลือหลังจากการหาปริมาณ LC-MS คือ <2 ppm แต่พีคที่ไม่รู้จักใหม่ปรากฏในการวิเคราะห์พีคใหม่นี้ไม่ตรงกับผลิตภัณฑ์มาตรฐาน BDDEผลิตภัณฑ์มาตรฐาน BDDE ยังผ่านการวิเคราะห์คุณภาพเดียวกัน (การแปลง MRM 203.30/129.10 Da) ในโหมด MRM เชิงบวกโดยทั่วไป วิธีการวิเคราะห์อื่นๆ เช่น โครมาโตกราฟีถูกใช้เป็นการทดสอบจำกัดเพื่อตรวจหา BDDE ในไฮโดรเจล แต่ขีดจำกัดการตรวจจับสูงสุด (LOD) ต่ำกว่า 2 ppm เล็กน้อยในทางกลับกัน จนถึงตอนนี้ NMR และ MS ถูกใช้เพื่อกำหนดลักษณะระดับของการเชื่อมโยงข้ามและ/หรือการดัดแปลงของ HA ในชิ้นส่วนหน่วยน้ำตาลของผลิตภัณฑ์ HA แบบเชื่อมขวางวัตถุประสงค์ของเทคนิคเหล่านี้ไม่เคยเป็นการหาปริมาณการตรวจจับ BDDE ที่ตกค้างที่ความเข้มข้นต่ำดังที่เราอธิบายไว้ในบทความนี้ (LOD ของวิธี LC-MS ของเรา = 10 ppb)
เวลาที่โพสต์: ก.ย.-01-2021